Synthesis of 8-aminoquinolines as inhibitors of tyrosine kinases

Abstract

Chronic myelogenous leukemia (CML), characterized by unregulated proliferation of myeloid cells in the bone marrow, accounts for 15 to 20 % of all adult leukemia cases in the Western population. The molecular cause for the disease is the characteristic translocation between chromosome 9 and 22 which results in the so called Philadelphia chromosome (Ph) and in the formation of the chimeric Bcr-Abl gene. In CML the protein product of this hybrid gene is a constitutively active protein kinase. Bcr-Abl kinase drives the pathogenesis of CML through the phosphorylation and activation of a broad range of downstream substrates playing a critical role in cellular signal transduction and cell transformation. ABL tyrosin kinase therefore is an interesting therapeutic target and many potent inhibitors have been developed and brought to the clinic in recent years, including Imatinib, Bosutinib, Nilotinib and Dasatinib. However, the T315I mutant form of Bcr-Abl, which is frequently found in CML patients, mediates complete resistance to Imatinib and all of the next generation Abl kinase inhibitors. Therefore, there is an eminent need for the development of drugs which are active against the T315I mutant of Bcr-Abl. Bosutinib and its quinoline scaffold have been chosen as a template for the construction of a new drug scaffold potentially able to inhibit the mutated Bcr-Abl. Starting from the model of Bosutinib bound to wild-type Abl kinase domain and the model of T315I Abl kinase domain it was apparent that in order to get potent inhibitors of Abl T315I the unfavorable interaction caused by the bulkiness of isoleucine had to be avoided and another strong favorable interaction should be added. The strategy to accomplish this goal was to remove the cyano group at 3 position of the quinoline and strengthen the interaction with the protein by adding an amino group at position 8 to establish an additional hydrogen bond with the backbone carbonyl of M318. Based on this rational, the scaffold of 8-aminoquinolines resulted to be promising for potential Bcr-Abl T315I inhibitors. Three main lines of compounds have been synthetized: 4-substituted-8-aminoquinolines, 3-substituted-8-aminoquinolines, 3,4-disubstituted-8-aminoquinolines. All of these molecules have an oxygen-linked alkyl group at position 7. Different groups have been employed to functionalize the position 7. 4-Substituted-8-aminoquinolines were synthetized starting from a 4,7-dihaloquinoline. Nitration of this molecule yielded the 8-nitro derivative which was then successfully functionalized firstly at position 7, and then at the position 4. Reduction of the nitro group allowed to obtain the desired 4-substituted-8-aminoquinolines. On the contrary, 3-substituted 8-aminoquinolines have been prepared starting from commercially available m-aminophenol. Nitration of this molecule yielded 2-nitro-3-aminophenol which was alkylated with an appropriate side chain at the phenolic oxygen and subsequently cyclized with -bromoacrolein to give the 3-bromo-7-oxyalkyl-8-nitroquinoline. This precursor has been employed for functionalization at position 3. As for the 4-substituted derivatives, the last step was the transformation of nitro group into amino group. 3,4-Disubstituted-8-aminoquinolines, after a first attempt of synthesis from a substituted aniline, were synthetized starting from 4,7-dichloro-8-nitroquinoline. Position 4 was firstly functionalized with an electron donating group such as methoxy or pyrrolidino and bromine was successively introduced at position 3 by an electrophilic aromatic substitution. Attachment of the side chain at position 7 was followed by reduction from 8-nitro to 8-aminoquinoline. For all the synthetized molecules, different groups have been attached at the specific positions either via an oxygen or a nitrogen or a carbon linker. Oxygen and nitrogen linked groups have been introduced in the quinoline scaffold with an aromatic nucleophilic substitution using the corresponding alcoholate or amide. Carbon linked groups have been introduced through palladium catalyzed cross coupling reactions involving the corresponding aryl or alkyl boronic acids. Two alkynyl groups have been introduced under the classic Sonogashira reaction conditions coupling and then reduced to alkyl with hydrogen. All of the molecules synthetized have been tested in biological assays in order to verify their activity toward the enzyme in solution and toward cells expressing the oncogenic enzyme. It was discovered that as hydrochloride salt, the inhibitors were more active than as free base, therefore many inhibitors have been tested as water-soluble salts. Good results have been obtained, since the scaffold resulted active in inhibiting the enzyme. Some of the compounds exhibited inhibitory activity in the nanomolar range. Seven of the most active and specific compounds have also been tested toward a panel of 85 protein kinases (Cohen Lab, Dundee) of different classes in order to asses their selectivity profile. Three compounds (CPD 131, 106 and 148) having nanomolar activity on T315I Abl resulted to have low selectivity on the panel, inhibiting respectively 10, 40 and 11 kinases by more of 50% at a concentration of 10 M. In contrast, CPD 142, 163, 167 and 138 resulted very selective. Among them, CPD 138 appears to be the most selective one because it inhibits only the Aurora A kinases by more than 50% at the tested 10 M concentration. All other compounds inhibited strongly PKB (AKT2) which is a Serine/Threonine kinase, while enzymes more related to Abl, e.g. LCK, SRC and FGFR1, are less targeted by the selected compounds. Insulin receptor kinase, a clear anti-target for protein kinase inhibitors, is not inhibited by these compounds. Interestingly there is an inverse correlation between the selectivity on cells (transduced cells versus non-transduced cells) and the PKB inhibitory activity. The higher the PKB inhibitory activity is the less selective are the compounds. This indicates that PKBis a target for substituted 8-aminoquinolines. In conclusion, a novel active scaffold for the inhibition of Abl WT and Abl T315I has been developed. Very active compounds both on the cellular and enzymatic level have been found. The synthetized Abl T315 inhibitors allowed to asses the proposed binding mode and gave a consistent SAR. Based on the obtained results it is clear that the 8-aminoquinoline-based inhibitors are lead compounds which can be further developed in an optimization process to gain activity and better selectivity in order to be able to enter in vivo studies.

La leucémie myéloïde chronique (LMC), caractérisée par une prolifération dérégulée des cellules myéloïdes dans la moelle osseuse, est responsable de 15 à 20% des cas de leucémie dans la population occidentale. La pathogénèse de cette maladie est liée à une translocation entre les chromosomes 9 et 22, résultant dans le fameux chromosome de Philadelphie et la formation d’un gène chimérique, Bcr-Abl. Dans le cas de la LMC, le produit de ce gène hybride est une protéine avec activité tyrosine-kinase, la Bcr-Abl kinase qui est constitutivement active. Elle induit de nombreuses phosphorylations et l’activation d’une large gamme de substrats responsables de la transduction de signaux et de la transformation des cellules. De ce fait elle représente une cible thérapeutique intéressante. Ainsi, de nombreux inhibiteurs potentiels, notamment l’Imatinib, le Bosutinib, le Nilotinib et le Dasatinib, ont récemment été développés et testés en phase clinique. Néanmoins, la forme mutée T315I de Bcr-Abl fréquemment trouvée dans les patients de LMC montre une résistance absolue contre Imatinib et les inhibiteurs de la Abl-kinase de deuxième génération tels que Bosutinib, Nilotinib ou Dasatinib. Ceci rend urgent la nécessité de développer de nouveaux principes actifs contre cette forme mutée.En premier lieu une molécule contenant un squelette quinolinique, le Bosutinib, a été choisie comme modèle pour la construction d’une nouvelle structure moléculaire, potentiellement capable d’inhiber la forme mutée de Bcr-Abl. Partant du modèle 3D de Bosutinib lié au site de liaison du domaine “wild type” de la kinase Abl et du modèle du domaine de la kinase T315I kinase, il paraissait évident pour une inhibition de Bcr-Abl T315I, que, d’une part, l’interaction défavorable causée par la chaîne latérale de l’isoleucine devait être évitée et que, d’autre part, une nouvelle interaction favorable devait être ajoutée. Pour ce faire, la stratégie était d’éliminer le groupement nitrile en position 3 de la quinoline et de renforcer l’interaction de la molécule avec la protéine par l’introduction d’un groupement aminé en position 8, créant ainsi une nouvelle liaison hydrogène avec la méthionine 318. Partant de ces hypothèses, le squelette 8-aminoquinolinique semblait être un candidat prometteur pour créer la base d’un inhibiteur de Bcr-Abl T315I. Ainsi, trois lignes principales de composés ont été synthétisées: 8-aminoquinolines substituée en position 4, 8-aminoquinolines substituée en position 3 et 8-aminoquinolines di-substituée en positions 3 et 4. Toutes ces molécules contiennent un groupement o-alkylique en position 7, divers groupements alkyliques ayant été utilisés. Les 8-aminoquinolines substituées en position 4 ont été synthétisées à partir d’une quinoline 4,7-di-halogénée. La nitration de cette molécule donne un dérivé, le 8-nitro, qui par la suite a été fonctionnalisé en position 7, puis en position 4. Enfin, la réduction du groupement nitrique a permis la synthèse de la 8-aminoquinoline 4-substituée. Les 8-aminoquinolines substituées en position 3, en revanche, ont été préparées à partir de m-aminophénole. Par nitration de cette molécule on obtient la 2-nitro-3-aminophénole. Celle-ci était ensuite alkylée sur l’oxygène phénolique avec une chaîne latérale appropriée, et successivement cyclisée avec -bromoacroléine donnant le précurseur 3-bromo-7-oxyalkyl-8-nitroquinoline qui peut être fonctionnalisé en position 3. De même que pour les dérivés substitués en position 4, le dernier pas consistait à réduire le groupement nitrique en amine. Les 8-aminoquinoline-3,4-disubstituées, après une première tentative à partir d’une aniline substituée, ont été synthétisées partant d’une base de 4,7dichloro-8-nitroquinoline. D’abord la position 4 était fonctionnalisée avec un groupement donneur d’électrons (méthoxy ou pyrrolidine), puis, le brome était successivement introduit en position 3 par moyen d’une substitution électrophile aromatique. L’attachement de la chaîne latérale en position 7 était suivi d’une réduction du groupe nitro en position 8 à amine pour donner la 8-aminoquinilone. Pour les molécules synthétisées, divers groupes ont été introduits dans les positions spécifiées à l’aide de linker d’oxygène, d’azote ou de carbone. Les groupements contenants un linker d’oxygène ou d’azote ont été introduits dans le squelette de quinoline par une substitution aromatique nucléophile en utilisant l’alcoolate ou l’amide correspondant. Les groupements carboniques ont été introduits à l’aide d’une réaction de couplage croisé (cross-coupling) des acides aryl- ou alkylboroniques avec palladium comme canalisateur. Deux groupements alkyliques ont été introduits par un couplement de Sonogashira avec une réduction successive du groupe alken en alkyl avec de l’hydrogène. Les molécules synthétisées ont été testées sur l’enzyme en solution ainsi que sur les cellules exprimant l’enzyme oncogénique afin de vérifier leurs activités. Il a été constaté que les sels hydrochloriques des inhibiteurs ont une activité plus importante comparé aux bases libres respectives. Pour cela la plupart des inhibiteurs a été testée en tant que sels hydrosolubles. Le squelette 8-aminoquinolinique s’est avéré être actif dans l’inhibition de l’enzyme muté allant jusqu’à une activité inhibitrice dans les nanomolaires pour quelques uns des composés. Entre les composés les plus actifs et spécifiques, sept étaient testés sur une série de 85-protéine-kinases de types variés (Cohen labs, Dundee) avec le but d’identifier leur profiles de sélectivité. Trois composés (CPD 131, 106 e 148) avec une activité inhibitrice nanomolaire sur Abl T315I ont montré une basse sélectivité avec une inhibition de plus de 50% de 10, 40 et 11 kinases, respectivement, à une concentration de 10 M. En revanche, CPD 142, 163, 167 et 138 avaient une forte sélectivité avec CPD 138 comme le plus sélectif avec comme seule activité inhibitrice à plus de 50% (concentration 10 M) une inhibition spécifique de la kinase Aurora A. Les autres composés avaient un grand effet inhibiteur sur la sérine/thréonine kinase, PKB (AKT2), tandis que les enzymes ressemblant à Abl, par ex. LCK, SRC e FGFR1, n’étaient quasiment pas inhibées par ces composés. Aucune inhibition n’a été détectée pour la kinase du récepteur de l’insuline qui est reconnue comme un «anti-target». Il est intéressant de noter qu’il existe une corrélation inverse entre la sélectivité sur les cellules (transduites et non-transduites) et l’activité inhibitrice des composés envers PKB les composés avec la plus haute activité inhibitrice sur PKB sont les moins sélectifs au niveau cellulaire. Ceci indique clairement que PKBest une cible pour la 8-aminoquinoline.Pour conclure, un nouveau «scaffold» (8-aminoquinoliniques) avec activité inhibitrice envers Bcr-Abl T315I et Bcr-Abl WT a été développé. Des composés actifs au niveau cellulaire ainsi qu’enzymatique ont été trouvés. Les inhibiteurs synthétisés ont donné une relation structure-activité (SAR) cohérente. D’après les résultats obtenus, il est évident que ces inhibiteurs sont des composés clés (lead compounds) qui ont le potentiel d’être optimisés dans leur activité et leur sélectivité en vue de leur application dans des études in vivo.

La leucemia mieloide cronica (CML), caratterizzata da una proliferazione deregolata delle cellule mieloidi nel midollo osseo, è causa del 15-20% di tutti i casi di leucemia nella popolazione. La causa molecolare della malattia è una caratteristica traslocazione tra i cromosomi 9 e 22, che genera il cosiddetto cromosoma Philadelphia (Ph) formando il gene chimericodi Bcr-Abl. Nella CML il prodotto proteico di questo gene ibrido è una protein-chinasi costitutivamente attiva. La tirosin-chinasi Bcr-Abl guida l’insorgere della malattia attraverso la fosforilazione e l’attivazione di un’ampia gamma di substrati localizzati a valle nella cascata dei segnali intracellulari, giocando un ruolo fondamentale nella loro trasmissione e nella trasformazione delle cellule. La tirosin-chinasi Bcr-Abl percio’ è un interessante bersaglio terapeutico e molti suoi potenti inibitori come ad esempio Imatinib, Bosutinib e Dasatinib, sono stati sviluppati e portati alla sperimentazione clinica negli ultimi anni. Nonostante cio’ la mutazione T315I di Bcr-Abl, che spesso viene riscontrata nei pazienti affetti da CML, risulta essere completamente refrattaria ad Imatinib ed a tutti gli inibitori di Bcr-Abl di seconda generazione. Per questo motivo lo sviluppo di farmaci in grado di inibire la forma mutata T315I di Bcr-Abl, è da considerarsi una priorità. Bosutinib, con il suo scheletro chinolinico, è stato scelto come modello per la costruzione di una nuova struttura molecolare potenzialmente capace di inbire la forma mutata di Bcr-Abl. Partendo dal modello computazionale di Bosutinib legato al domino chinasico di Bcr-Abl, e dal modello del dominio chinasico di Bcr-Abl T315I, risultava evidente che per ottenere inibitori di Bcr-Abl T315I, l’interazione sfavorevole causata dalla catena laterale dell’isoleucina doveva essere evitata, ed una nuova forte interazione favorevole doveva invece essere creata. La strategià percio’ utilizzata prevedeva la rimozione del nitrile presente in posizione 3 della chinolina e il rinforzo delle interazioni con la proteina tramite l’introduzione di un gruppo amminico in posizione 8 in grado di formare un legame a idrogeno con la metionina 318. Basandosi su questi presupposti lo scheletro 8-amminoquinolinico che ne risulta, sembrava essere promettente per lo sviluppo di inibitori di Bcr-Abl T315I. Tre principali linee di composti sono state sintetizzate: 8-amminochinoline-4-sostituite, 8-amminochinoline-3-sostituite, 8-amminochinoline-3,4-disostituite. Tutte queste molecole hanno in posizione 7 un gruppo O-alchilico, e diversi gruppi alchilici sono stati utilizzati. Le 8-amminochinoline-4 sostituite sono state sintetizzarte partendo da una 4,7-dialogenochinolina. La nitrazione di questa molecol ha dato l’8-nitro derivato che è stato successivamente funzionalizzato prima alla posizione 7 e poi alla posizione 4. La riduzione del nitrogruppo ha permesso infine di arrivare alle 8-amminochinoline-4-sostituite. Le 8-amminochinoline-3-sostituite invece, sono state preparate partendo dal m-amminofenolo. La nitrazione di questsa molecola ha dato il 2-nitro-3-amminofenolo, il quale poi è stato alchilato sull’ossigeno con una particolare catena laterale, e successivamente ciclizzato con -bromoacroleina per dare 3-bromo-7-ossialchil-8-nitrochinolina. Questo precursore è stato utilizzato per funzionalizzare la posizione 3. Come per le 4-sostituite, l’ultimo passaggio della sintesi era la riduzione del nitrogruppo ad ammina. Le 8-amminochinoline-3,4-disostituite dopo un primo tentativo di sintesi da un’anilina sostituita, sono state sintetizzate a partire dalla 4,7-dicloro-8nitrochinolina. La posizione 4 è stata funzionalizzata subito con un gruppo elettron-donatore ( metossi o pirrolidina) e successivamente il bromo è stato introdotto nella posizione 3 con una sostituzione elettrofila aromatica. Il susseguente posizionamento della catena laterale in posizione 7 è stato seguito dalla riduzione da 8-nitro ad 8-amminochinolina. Per tutte le molecole sintetizzate gruppi diversi sono stati introdotti alle specifiche posizioni: gruppi legati tramite un atomo di carbonio, di ossigeno o di azoto. I gruppi legati tramite atomi di ossigeno o di azoto sono stati introdotti nella chinolina con reazioni di sostituzione elettrofila aromatica, usando il corrispondente alcolato o ammide. I gruppi legati tramite atomo di carbonio sono stati introdotti atteaverso reazioni di cross-coupling catalizzate da palladio, dei corrispondenti acidi boronici alchilici o arilici. Due gruppi alchinici sono stati introdotti con un coupling di Sonogashira, e successivamente ridotti ad alchili tramite idrogenazione. Tutte le molecole sintetizzate sono state testate in saggi biologici per verificarne l’attività verso l’enzima in soluzione e verso cellule che esprimono l’enzima oncogenico. Si è scoperto che il cloridrato degli inibitori è sempre piu attivo delle rispettive basi libere, percio’ molti inibitori sono stati testati come cloridrati idrosolubili. Buoni risultati sono stati ottenuti, dal momento in cui lo scheletro 8-amminochinolinico è risultato attivo nell’inibire l’enzima mutato. Alcuni dei composti presentano attività nel nanomolare. Sette tra i composti piu’ attivi e specifici sono anche stati testati su una serie di 85 protein-chinasi di diverso tipo (Cohen labs, Dundee) allo scopo di verificarne il loro profilo di selettività. Tre composti (CPD 131, 106 e 148) che posseggono attività nanomolare su Abl T315I sono scarsamente selettivi, inibendodi piu del 50% rispettivamente 10, 40 e 11 altre chinasi ad una concentrazione di 10M. Al contrario CPD 142, 163, 167 and 138, risultano essere molto selettivi, e tra i tre CPD 138 è il piu selettivo dato che inibisce solamente la chinasi Aurora A di piu del 50% alla concentrazione di 10M. Tutti gli altri composti inibiscono pesantemente PKB (AKT2) che è una serin-treonin-chinasi, mentre enzimi piu simili ad Abl, come ad esempio LCK, SRC e FGFR1 sono meno inibiti da questi composti. L’Insulin receptor kinase, che è un enzima che non deve essere inibito dagli inibitori per le protein-chinasi, non è sensibile a questi composti. Interessante è la correlazione tra la selettività sulle cellule (trasdotte contro non trasdotte) e l’attività dei composti verso PKB : piu’ elevata è l’attività su PKB e minore è la selettività del composto. Questo indica chiaramente che PKB è un target per le 8-amminochinoline. Concludendo, un nuovo scaffold attivo per l’inbizione di Bcr-Abl WT e Bcr-Abl T315I è stato sviluppato. Composti molto attivi sia a livello enzimatico che cellulare sono stati trovati. Gli inibitori sintetizzati hanno permesso di accertare il binding-mode proposto e hanno dato una SAR coerente. Basandosi sui risultati ottenuti, è chiaro che gli inibitori 8-amminochinoloinici sono lead-compounds che possono essere ulteriormente sviluppati in un processo di ottimizzazione allo scopo di aumentarne selettività ed attività per poter iniziare degli studi in vivo