The activity and stability of most of proteins in a biological organism are subject
to metal ion binding. Heavy metals such as arsenic and mercury are able to interact with proteins and, due to their impact on human health and environmental pollution, they represent a priority investigation field. Moreover, the contribution of these metals to the pathological processes, requires an in-depth understanding of the
protein targets. Studying the nature of these interactions require the most appropriate analytical method. In order to verify the most suitable operational conditions, the in vitro interactions in proteins-rich foodstuffs (such as: milk, eggs and food grade gelatin) with some As and Hg compounds have been evaluated. Then, some naturally exposed samples have been analyzed in order to study any in vivo interactions. Samples have been separated using SEC chromatography and metals eluted
have been detected by ICP-MS, while proteins have been identified by MALDI-TOF. The results showed that arsenical compounds had strictly species-specific interactions,
while for mercury compounds fewer differences have been found. Since the
use of ICP-MS for the analysis of biomolecules containing heteroatoms can give us several advantages in terms of sensitivity and specificity, a part of this PhD thesis has been devoted to protein labeling techniques. The study has been focussed on the development of an HPLC-ICP-MS hetero-atom tagging method for the identification of intact proteins isolated from painting layers. The proteins labeling has been performed using the metal element-chelated tag (MECT) procedure. The analytical procedure has been firstly tested on proteins standard. Then, the characterization of proteinaceous binders typically used in paints from past centuries has been performed. The proteins extraction and purification procedures have been evaluated using reconstructed pictorial models before testing the effectiveness of the method on some unknown samples.
Arsenico e mercurio metalli noti perla loro capacità di interagire con le proteine e, a causa dell’ impatto che hanno sulla salute e sull’inquinamento ambientale, essi rappresentano un campo d’indagine prioritario. Data la natura dell’interazione
metallo-proteina, è stata valutata la metodica più adatta per lo studio di questo
tipo di interazioni. Le condizioni operative sono state inizialmente sviluppate in vitro utilizzando alimenti ricchi di proteine quali: latte, uova e colla di pesce in presenza di alcune specie di As e Hg. Successivamente, alcuni campioni naturalmente
contaminati sono stati analizzati con lo scopo di individuare in vivo le interazioni
che questi metalli hanno instaurato con la componente proteica. Gli analiti sono stati separati con colonna SEC. L’eluizione dei metalli è stata rilevata tramite ICPMS,
mentre le proteine sono state identificate con strumentazione MALDI-TOF. I risultati ottenuti mostrano che la reattività chimica dell’arsenico è strettamente specie-specifica, mentre per le specie mercurio minori differenze sono state trovate. Poiché l’uso della strumentazione ICP-MS per lo studio delle biomolecole contenenti eteroatomi ha offerto innegabili vantaggi in termini di sensibilità e specificità, nella seconda parte della tesi di dottorato è stato valutato l’utilizzo delle tecniche
di marcatura delle proteine con metalli. Lo studio si è focalizzato nello sviluppo di
una metodica HPLC-ICP-MS per l’identificazione delle proteine estratte da strati pittorici. La derivatizzazione delle proteine è stata effettuata utilizzando la tecnica del metal element-chelated tag (MECT). La procedura analitica è stata sviluppata utilizzando inizialmente delle proteine standard. Successivamente è stata eseguita la caratterizzazione delle proteine presenti nei leganti pittorici tipicamente utilizzati negli affreschi e sono state valutate le procedure di estrazione più appropiate utilizzando dei modelli pittorici ricostruiti in laboratorio. Infine, per testare l’efficacia del metodo sviluppato, alcuni campioni incogniti di strati pittorici sono stati analizzati.
